Kísérlet mély-ultraibolya 222nm-es szilárd állapotú-lézerrel 3
5.2.4 222 nm-es mély-ultraibolya pulzáló lézer kimenete
5.16. ábra A 457 nm-es impulzuslézer átlagos teljesítményének és impulzusszélességének változása befecskendezett szivattyúteljesítménnyel 15 kHz-es ismétlési frekvencián
A bal tengely a 457 nm-es lézer átlagos teljesítményét mutatja mW-ban (200-700), a jobb tengely az impulzusszélességet ns-ben (40-120), a vízszintes tengely pedig a befecskendezett szivattyú teljesítményét W-ban (30-42).
Az egyik görbe az átlagos f{0}kHz-es teljesítménynek felel meg, amely körülbelül 650 mW-ról körülbelül 350 mW-ra csökken. A másik görbe az impulzusszélességnek felel meg, körülbelül 50 ns-ról körülbelül 110 ns-ra.
5.17. ábra: 457 nm-es impulzuslézer szpot és sugárminősége 600 mW maximális átlagos teljesítmény mellett 10 kHz ismétlési frekvenciával (lásd a színdiagramot)
A bal oldali rész egy pontdiagram, a jobb oldali pedig egy gerenda minőségi diagram.
A sugárminőség diagramban a vízszintes tengely a terjedési tengely mentén elhelyezkedő pozíciót jelöli mm-ben (0-200), a függőleges tengely pedig a folt átmérőjét mm-ben (0-4). Két görbe van "x horizontális" és "y függőleges" címkével, My²=1.32 és Mx²=1.15. jelöléssel. A görbék először csökkennek, majd növekednek, a minimális érték 100 mm körül van, a folt átmérője pedig körülbelül 0,5 mm.
A fent említett 457 nm-es impulzusos lézerkísérletből a legnagyobb csúcsteljesítményű 457 nm-es impulzusos lézerkimenetet akkor kapjuk, ha a szivattyúfolt sugara körülbelül 200 μm, az L1 és L2 körülbelül 83 mm és 31 mm, az ismétlési frekvencia pedig 10 kHz. Ezt a 457 nm-es impulzuslézert fényforrásként használják 222 nm-es impulzuslézer generálására a frekvencia megduplázásával egy BBO kristállyal. Az M3 fókuszáló tükör és a BBO kristály elhelyezési pozícióinak folyamatos 222 nm-es kibocsátásához, mivel a 457 nm-es impulzusos lézerkimenet sugárminősége eltér a 457 nm-esétől, szükséges az M3 fókusztükör és a BBO kristály elhelyezési pozícióinak megfelelő beállítása. Ez biztosítja, hogy miután a 457 nm-es impulzuslézer áthalad az M3 fókusztükrön, Rayleigh-hossza megegyezik a BBO kristály hosszával, hogy javítsa a frekvencia megduplázódási hatékonyságát. Végül egy 222 nm-es impulzusos lézerkimenet érhető el, amelynek maximális átlagos teljesítménye 35 mW és 36 n-es impulzusszélesség (a detektoron mért közvetlen lézeres beeséssel mérve). Míg a kereskedelemben kapható 222 nm-es uvc led vagy 222 nm uvc lámpa szélesebb körű alkalmazásokhoz is elérhető, ez a szilárdtestrendszer precíz impulzuskimenetet biztosít. Az 5.18. ábra az ultraibolya lézer spektrumát mutatja. A 222 nm-es impulzuslézer átlagos kimeneti teljesítménye a 457 nm-es impulzuslézer befecskendezett teljesítményének növekedésével növekszik, és a változási összefüggést az 5.19. ábra mutatja. Az 5.20. ábra a 222 nm-es impulzuslézer lézerpontdiagramja a legnagyobb átlagos kimeneti teljesítmény mellett.
5.18. ábra Ultraibolya lézerspektrum
A vízszintes tengely a hullámhossz nm-ben (200-260), a függőleges tengely pedig az intenzitás (0-15000). A csúcs 222 nm körül van.
5.19. ábra: 222 nm-es impulzuslézer átlagos kimenő teljesítményének változása 457 nm-es impulzuslézer befecskendezett teljesítményével 10 kHz-es ismétlési frekvencián
A vízszintes tengely a 457 nm-es lézer befecskendezett teljesítménye mW-ban (200-600), a függőleges tengely pedig a 222 nm-es lézer átlagos teljesítménye mW-ban (0-40). A görbe lineárisan emelkedik, körülbelül 5 mW-ról körülbelül 35 mW-ra.
5.20. ábra: 222 nm-es impulzuslézer lézerpontja a legnagyobb átlagos kimeneti teljesítmény mellett (lásd a színdiagramot)
A folt gyűrű alakú, négyzetes körvonallal.
5.21. ábra A 222 nm-es impulzusos lézer kimeneti teljesítményének stabilitása
Ha a 222 nm-es impulzuslézer maximális átlagos kimeneti teljesítménye 35 mW, akkor a lézer kimeneti teljesítményének stabilitását mérik. Amint az 5.21. ábrán látható, a lézer kimeneti stabilitása 2 órán belül 2%-on belül van.
A vízszintes tengely az idő percben (0-120), a függőleges tengely pedig a 222nm-es lézer átlagos teljesítménye mW-ban (0-50). A görbe alapvetően stabil, 35mW körül ingadozik.
5.3 Kísérlet a baktériumok inaktiválására 222 nm-es impulzuslézerrel
5.3.1 A távoli ultraibolya fény elve és alkalmazási előnyei a baktériumok inaktiválásához
1903-ban Niels Finsen Nobel-díjat kapott, mert felfedezte, hogy az ultraibolya fény képes elpusztítani a baktériumokat. A következő évszázadban az ultraibolya fényt széles körben használták fertőtlenítési módszerként tárgyak, kórtermek és más nyilvános helyek fertőtlenítésére. A folyamatban lévő COVID-19 világjárvány idején a világ országainak sürgősen új módszerekre van szükségük a levegőben lévő vírusok inaktiválására. A fotodinamikus sterilizálásnak és fertőtlenítésnek két fő módja van: fotokémiai és fototermikus hatás.
(1) Fotokémiai hatás A baktériumok genetikai információs nukleinsavai (DNS/RNS) besugárzáskor nagy mennyiségű ultraibolya fényt nyelnek el. Ez diazabenzolok és diazabenzolok izomereinek képződéséhez vezet a szervezetben, amint azt az 5.22. ábra mutatja. Ez az anyag megzavarja a baktériumok anyagcsere funkcióit, megakadályozva a szaporodásukat, amíg el nem pusztulnak. Ez a fotokémiai hatás a hagyományos ultraibolya fény fő fertőtlenítési mechanizmusa. A penészgombák és spórás mikroorganizmusok esetében azonban az ultraibolya fény nehezen hatol be sűrű sejtfalszerkezetükbe, így a DNS nem képes elnyelni az ultraibolya fényt, ami viszonylag alacsony fertőtlenítési hatékonyságot eredményez ezen mikroorganizmusok számára.
5.22. ábra A kettős-szálú DNS timin-dimerizációjának sematikus diagramja ultraibolya besugárzás hatására (lásd a színdiagramot)
Bemutatja azt a folyamatot, amikor a kettős{0}}szálú DNS timin dimereket képez UV-sugárzás hatására.
(2) Fototermikus hatás A pulzáló fénybesugárzás gyorsan növelheti a sejtek felszíni hőmérsékletét, tönkreteheti a baktériumok sejtfalát, elpárologtatja a sejtfolyadékot, és teljesen károsíthatja a sejtszerkezeteket, ami halálhoz vezethet. A fototermikus hatás a fényenergia anyagok általi elnyelése által okozott hőmérséklet-emelkedés. Ha a mikroorganizmusokat közelről intenzív pulzáló fénnyel sugározzák be, akkor rövid idő alatt nagy mennyiségű fényenergiát nyelnek el, aminek következtében felületi hőmérsékletük meredeken emelkedik, felületi struktúráik pedig teljesen tönkremennek, ami halált okoz. Mivel a teljes fototermikus hatásfolyamat nagyon rövid, ezért a besugárzott tárgy belsejében nincs hőmérséklet-emelkedés, így az alapvetően nem befolyásolja a tápanyagokat. A fototermikus fertőtlenítési mechanizmus szerint az intenzív pulzáló fény hatékonyan képes elpusztítani minden mikroorganizmust. Az impulzusos ultraibolya fény a fotokémiai és fototermikus hatásokat egyesíti a sterilizálás és fertőtlenítés érdekében, így elméleti fertőtlenítési hatékonysága magasabb, mint egyetlen módszeré. A sterilizálás hagyományos ultraibolya fényforrása a higanygőzlámpa. A higanygőzlámpák által kibocsátott ultraibolya fény csúcs hullámhossza azonban 254 nm, ami káros az emberi sejtekre és szövetekre, súlyos esetekben bőrrákot [4] és szürkehályogot is okozhat. Az elmúlt évtized kutatásai kimutatták, hogy a 200{12}}230 nm-es ultraibolya fény inaktiválhatja a baktériumokat, a levegőben lévő influenzavírusokat és a kórokozókat, például a SARS-CoV-2-t anélkül, hogy károsítaná az emberi sejteket. A 200-230 nm-es sávban lévő mély-ultraibolya fényt „távol-ultraibolya fénynek nevezik”, amelyet gyakran távoli UV-fény 222 nm-es rendszereken keresztül valósítanak meg. 2022-ben a pekingi téli olimpián széles körben alkalmazták a távoli-ultibolya fényt sterilizálásra és fertőtlenítésre, „könnyű vakcinának” nevezve. Azok számára, akik 222 nm-es uv-fényt keresnek eladásra, választhatnak a 222 nm-es uvc LED modulok vagy a 222 nm-es uvc lámpatestek, amelyek hasonló, 222 nm-es távoli UV fényt kínálnak kompakt formában. A sterilizáláshoz használt tipikus 254 nm-es ultraibolya fénnyel összehasonlítva az a biofizikai alapelv, hogy a távoli ultraibolya fény ártalmatlan az emberi sejtekre, hogy a fehérjéknek ebben a sávban van abszorpciós csúcsa. Ebben a kísérletben spektrofotométert használunk a fehérje abszorpciós spektrumának mérésére, amint azt az 5.23. ábra mutatja. Az 5.23. ábrán látható, hogy a fehérjék fényelnyelése nagyon alacsony a tipikus 254 nm-es sávban, de viszonylag magas a 200{53}}230 nm-es sávban. A távoli ultraibolya fény áthatol az emberi sejteknél jóval kisebb mikroorganizmusokon (a baktériumok és vírusok tipikus átmérője 1 μm és 0,1 μm) [11], míg a tipikus emberi sejtek átmérője 10 és 25 μm között van. A távoli ultraibolya fényt az emberi citoplazmában lévő fehérjék erősen elnyelik, és élesen gyengülnek, mielőtt elérnék az emberi sejtmagot [6]. Például az emberi bőr legkülső rétege a stratum corneum, amely elhalt sejtmagvú keratinocitákból áll. A stratum corneum fő feladata az alatta lévő bőr alatti szövet védelme. A besugárzott távoli ultraibolya fény nagy részét a bőr stratum corneum citoplazmájában lévő fehérjék abszorbeálják, és nem tud áthatolni a bőr stratum corneumon, hogy elérje az alábbi kulcsfontosságú bazális sejteket vagy melanocitákat, amint az az 5.24. ábrán látható. Az emberi szem számára az ultraibolya fényre érzékeny szövet a lencse. A lencse azonban a szaruhártya hátsó részén található, és a szaruhártya körülbelül 500 μm vastag. Ezért a távoli ultraibolya fény áteresztőképessége a szaruhártyán keresztül a lencsébe alapvetően nulla.
5.23. ábra Fehérjeabszorpciós spektrum
A vízszintes tengely a hullámhossz nm-ben (200-300), a függőleges tengely pedig az abszorpciós érték (0-3,0). A görbén három pont található: (222, 1,41), (230, 1,25) és (254, 0,168). Az abszorpciós érték a hullámhossz növekedésével csökken.
5.24. ábra: Az ultraibolya fény terjedésének sematikus diagramja a bőrben és a kórokozókban
A bal oldalon a bőr szerkezete látható, ahol az ultraibolya fényt a stratum corneum elnyeli-. A jobb oldalon a megnagyobbodott kórokozó látható, ahol a távoli-ultraibolya fény behatol és hat a baktériumokra és vírusokra.
5.3.2 Kísérlet a baktériumok inaktiválására 222 nm-es impulzuslézerrel
Baktériumkészítmények Az Escherichia coli széles körben jelen van a természetben, és az emberi közegészségügy kulcsfontosságú kórokozója, az Enterobacteriaceae egyik leggyógyszer--rezisztens faja, és gyakran használják az ultraibolya fertőtlenítés és a környezethigiénia kutatásában. A Bacillus ételmérgezés okozója az emberrel közeli rokonságban áll, spóráinak hőállósága és savállósága miatt sem pasztőrözéssel, sem normál higiéniai eljárásokkal nem távolítható el. Ezért a kísérletben használt baktériumtörzsek az Escherichia Coli és a Bacillus Cereus. Az Escherichia coli és a Bacillus az Escherichia coli [Escherichia coli CMCC (B) 44102], amelyet az Oktatási Minisztérium Trópusi Szigetök Ökológiai Kulcslaboratóriuma (Hainan Normal University) biztosít, és a Bacillus thuringiensis alfaj, kurstaki HD-1 a Hainlyan Normal University Environmental Microbiology Ecology Research Laboratory-tól. Az Escherichia colit és a Bacillust tápagar tápközegben tenyésztjük, inkubátorba helyezzük 35 °C-on és 5% CO₂-on, 24 órás tenyésztési periódus mellett. A tápagar táptalajt a Guangdong Huankai Microbial Technology Co., Ltd. biztosítja, és összetevői közé tartozik a pepton, a marhahús-kivonat por, a nátrium-klorid és az agar, amelyek végső pH-értéke ≈ 7,3. A tenyésztett baktériumokat tárgylemez-előkészítéssel figyeljük meg. Az Escherichia colit példának vesszük, a tárgylemez elkészítési lépéseit az 5.25. ábra, a megfigyelési eredményeket pedig az 5.26. ábra mutatja.
Metszetfelvétel: A tárgylemezeket alkoholos oldatban tároljuk, kivesszük és hőlégfúvóval szárítjuk.
Steril vízcsepp: Egy szuper-tiszta munkaasztal alatt cseppentsen egy csepp steril vizet a tárgylemezre (nem túl nagy), hogy hígítsa a baktériumokat.
Mintavétel: Használja a sterilizált fogpiszkáló lapos végét, hogy óvatosan merítse a baktériumokat a telepből; a fogpiszkáló nem használható újra.
Keverés: Az óramutató járásával megegyező irányban keverje a baktériumokat, hogy azok teljesen és egyenletesen eloszlajanak a vízcseppben.
Sütés: Szárítsa meg a kezelt tárgylemezt, hogy a baktériumok megkötődjenek a tárgylemezen.
Festés: Cseppents Coomassie Brilliant Blue reagenst (mérgező, használjon kesztyűben) a tárgylemezre, így a csepp éppen elfedi a bakteriális lepedéket, és hagyja állni több mint 15 másodpercig.
Öblítés: Lassú vízáramlással öblítse le a felesleges Coomassie Brilliant Blue reagenst, ügyelve arra, hogy ne öblítse le közvetlenül a bakteriális lepedéket, nehogy elmosódjon.
Megfigyelés: Helyezze a tárgylemezt a mikroszkóp tárgyasztalára, cseppentsen egy csepp olajat a bakteriális lepedékre, majd olajimmerziós lencsével figyelje meg.
5.25. ábra A bakteriális tárgylemez előkészítésének lépései
Nyolc lépésből álló képfolyamatot foglal magában: "dia felvétel és szárítás", "steril vízcsepp", "mintavétel", "keverés", "sütés", "festés", "öblítés" és "megfigyelés".
5.26. ábra Mikroszkóp alatt megfigyelt bacillus képe
Számos rúd alakú Bacillus{0}} látható rajta.
A baktériumok inaktivációjának hatása A besugárzási forrás egy 222 nm-es teljes-szilárdtest-impulzusos távoli-ultraibolya lézer, amelyet ebben a munkában fejlesztettek ki, spektrális vonalszélessége kisebb, mint 0,1 nm. A teljes kísérleti művelet tiszta helyiségben történik. A kísérleti eszközöket nagynyomású-sterilizálóval sterilizálják, és a munkapadot ultraibolya fénnyel sugározzák be 1 órán át a kísérlet előtt, hogy elkerüljék a környezet bakteriális szennyeződését. A küvettát a baktériumszuszpenzió behelyezése után lezárjuk, hogy elkerüljük a szuszpenziónak a külső levegővel való közvetlen érintkezését. A kísérlet során a baktériumok tápfolyadékban vannak, hogy elkerüljék a természetes halál okozta kísérleti hibákat. Vegyünk 1 ml-es mintákat bizonyos koncentrációjú Escherichia coli és Bacillus szuszpenziókból, és helyezzük azokat egy küvettába, amely nagy áteresztőképességgel rendelkezik a rövid{13}}hullámú ultraibolya sávban. Kapcsolja be a lézert, és a lézer kimeneti teljesítményének és a küvetta elhelyezési pozíciójának beállításával a 222 nm-es lézer besugárzása a küvettán 0,1 mW/cm². Használjon 0,1 mW/cm² 222 nm-es lézert Escherichia coli és Bacillus szuszpenziós minták besugárzására különböző besugárzási időkhöz. Az 5.27 (a) ábra az Escherichia coli szuszpenzión függőlegesen áthaladó 222 nm-es lézert mutatja. A kontrollmintákat és a besugárzott mintákat további 24 órán át tenyésztjük, és a besugárzatlan és besugárzott baktériumok eloszlását az 5.27 (b) és (c) ábra mutatja. Az Escherichia coli baktériumszámának meghatározására a kontrollcsoportban és besugárzás után a tápagar lemezszámláló módszert alkalmazzák. A kísérleti adatok pontosságának javítása érdekében minden mintát 3-szor megismételünk azonos besugárzási dózis mellett, és az átlagértéket veszik.
Ábra: 5.27 222nm pulzáló lézeres sterilizálási kísérlet
a) Escherichia coli szuszpenzió besugárzás alatt;
(b) Escherichia coli eloszlása 0 másodperces, 10 másodperces és 20 másodperces besugárzás után, miközben a telepek száma a lemezen a besugárzási idő növekedésével csökken;
(c) A Bacillus eloszlása 0, 30 és 60 másodperces besugárzás után, a telepek száma a lemezen a besugárzási idő növekedésével csökken.
A vizsgálati eredményeket az 5.1. táblázat tartalmazza. Ha a 222 nm-es lézer 10 másodpercig besugározza az Escherichia coli szuszpenziót (1 mJ/cm²), az inaktiválási arány 90,7%; 15 másodpercig (1,5 mJ/cm²) az inaktiválási arány 96,9%; és 20 másodpercig (2 mJ/cm²) az inaktiválási arány akár 100%. Ha a 222 nm-es lézer 30 másodpercig besugározza a Bacillus szuszpenziót (3 mJ/cm²), az inaktiválási arány 88,4%; 45 másodpercig (4,5 mJ/cm²) az inaktiválási arány 98,6%; és 60 másodpercig (6 mJ/cm²) az inaktiválási arány akár 100%. Ez a kísérleti tanulmány azt mutatja, hogy a 2mJ/cm² és 6mJ/cm² dózisú, 222 nm-es ultraibolya lézerrel végzett besugárzás hatékonyan inaktiválhatja az Escherichia colit, illetve a Bacillust. Ebből a kísérletből és más irodalmi közleményekből látható, hogy a Bacillus ultraibolya fénnyel történő inaktiválásához szükséges besugárzási dózis nagyobb, mint az Escherichia coli esetében. Ennek az az oka, hogy a baktériumok és vírusok ultraibolya fénnyel történő inaktiválásához szükséges besugárzási dózis főként olyan tényezőktől függ, mint a mikroorganizmusok mérete, a sejtmembránok (falak) vastagsága és a nukleinsavak szerkezete (egyszálú vagy kettős{30}}szálú). Általában minél nagyobb a mikroorganizmus mérete és minél vastagabb a sejtmembrán, annál nagyobb besugárzási dózisra van szükség; a kettős-szálú szerkezetű mikroorganizmusok erősebb javítóképességgel rendelkeznek, mint az egyszálú szerkezetűek, ezért nagyobb besugárzási dózisra is szükség van. Mind a Bacillus, mind az Escherichia coli kettős szálú szerkezettel rendelkezik, de a Bacillus mérete és sejtfalvastagsága (1,0-1,2) nm × (3,0-5,0) nm, illetve 20-80 nm, míg az Escherichia coli-é csak (0,5-0,8)-0,0 × 1,0 nm. Ezért a Bacillus inaktiválásához szükséges ultraibolya besugárzási dózis nagyobb, mint az Escherichia coli esetében.
